測序酶是基因測序、文庫構(gòu)建及分子診斷的核心工具，其活性與特異性直接影響數(shù)據(jù)質(zhì)量與實驗成敗。在實際操作中，常因保存不當、反應體系失衡或模板質(zhì)量問題導致擴增失敗、偏好性偏差或背景噪音升高?？茖W識別
測序酶問題根源并采取針對性措施，是保障測序結(jié)果可靠性的關(guān)鍵。
一、擴增效率低或無產(chǎn)物
原因：酶失活、模板降解、引物設(shè)計不佳或Mg濃度不足。
解決方法：
確認酶活性：避免反復凍融，使用前短暫離心，按說明書要求在–20℃或–80℃保存；
檢測模板質(zhì)量：用Nanodrop或Bioanalyzer驗證DNA/RNA完整性（A260/A280≈1.8–2.0，RIN＞7）；
優(yōu)化引物Tm值與特異性，避免二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)；
進行梯度PCR，調(diào)整Mg（通常1.5–3.0mM）或dNTP濃度。
二、非特異性條帶或引物二聚體
多因退火溫度過低或酶用量過多：
提高退火溫度（建議比Tm低3–5℃起步），采用熱啟動型聚合酶抑制低溫非特異擴增；
減少酶量（如從1U降至0.5U/50μL），避免過度延伸；
添加DMSO（3%–5%）或甜菜堿（1M）改善高GC模板擴增特異性。
三、測序文庫產(chǎn)量低或片段分布異常
常見于NGS建庫環(huán)節(jié)：
末端修復/加A尾不全：確保各步酶反應時間充足（通常20–30分鐘），使用新鮮ATP；
接頭連接效率低：控制插入片段與接頭摩爾比（通常3:1–6:1），避免接頭自連；
純化損失過大：選用高回收率磁珠（如SPRIselect），嚴格控制乙醇洗滌次數(shù)與晾干時間。
四、逆轉(zhuǎn)錄失?。╟DNA產(chǎn)量低）
使用無RNase耗材，RNA提取后立即反轉(zhuǎn)錄；
對長鏈或二級結(jié)構(gòu)豐富的RNA，選用含RNaseH突變的高性能逆轉(zhuǎn)錄酶（如SuperScriptIV）；
添加隨機六聚體+Oligo(dT)混合引物，提升覆蓋均勻性。
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