發(fā)布時(shí)間： 2021-07-25 點(diǎn)擊次數(shù)： 1274次
對于菌落試驗(yàn)來說按照一般的步驟，可以把每個(gè)菌落挑出來進(jìn)行培養(yǎng)提取質(zhì)粒，然后質(zhì)粒進(jìn)行測序或者酶切驗(yàn)證目的片段。但是從培養(yǎng)細(xì)菌到最后送測序，花費(fèi)太多時(shí)間。如果說只有一個(gè)菌落去驗(yàn)證，那工作量倒不是很大。但萬一有100個(gè)菌落就比較麻煩。那么我們就可以通過
PCR儀進(jìn)行菌落PCR篩選。
基本步驟如下：
1.單菌落挑取
把LB培養(yǎng)基倒入排槍槽中，然后用排槍加400μL LB培養(yǎng)基到48孔深孔板，用鑷子拿已滅菌的小白槍頭挑取平板上的單菌落并放到48孔深孔板中，同時(shí)在48孔深孔板和相應(yīng)的表單上做好記錄，注意對于藍(lán)白斑篩選的板子要挑的是白斑。挑好的48孔深孔板用封口膜蓋好并做好相應(yīng)標(biāo)記（日期、板號(hào)等），用針頭在封口膜打孔，把它放在37搖床上搖一個(gè)小時(shí)。
2.菌落PCR反應(yīng)
配置好PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系，把配好的反應(yīng)液加到96孔反應(yīng)板中，用排槍加2.5μL的菌液到其中，注意在96孔反應(yīng)板上做好標(biāo)記。把96孔反應(yīng)板放在PCR儀上蓋好橡膠墊，按照PCR反應(yīng)條件設(shè)置反應(yīng)程序，注意一定要把PCR儀的蓋子蓋緊。
3.瓊脂糖凝膠電泳
一般先配置1.0%-1.2%瓊脂糖凝膠（即稱1.2g的瓊脂糖加100ml的TAE），在96孔反應(yīng)板每個(gè)管中加0.5μL的溴酚藍(lán)，震蕩均勻，然后點(diǎn)樣，電泳好的瓊脂糖凝膠拍照，命名保存。
4.判斷陽性克隆并測序
根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳圖條帶來判斷陽性克隆，把陽性克隆的菌液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，進(jìn)行測序驗(yàn)證，看看是否有*正確的序列。
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